2 c# Q7 }; k) J/ W+ I* |4 x早期科学家用电生理研究生物钟，插电极到细胞观察电活动，曾观察到脑内特定部位SCN（视交叉上核，suprachiasmatic nucleus）的电活动有昼夜周期。用解剖学研究，可以了解哪个器官、组织、部位对于个体的生物钟至关重要。这一类研究中，在鸟类发现松果体很重要（Gaston and Menaker，1968；Zimmerman and Menaker，1979），而哺乳类动物的主钟（master clock）被认为是SCN。确定主钟的实验有三类，以SCN为例：损毁它会导致动物失去昼夜节律（Moore and Eichler，1972；Stephan and Zucker，1972）；将它加回，损毁后的动物可恢复昼夜节律（Lehman et al., 1987）；在捣毁后，移植其它动物的SCN，新节律与移植物来源的动物节律一样，例如，如果移植物来自周期22小时的动物，那么接受移植的动物周期也是22小时，而如果移植物来自周期20小时的动物，接受移植的动物也获得20小时的周期（Ralph et al., 1990）。* L5 r" q# H2 Z4 \8 O4 r
7 d4 t, ~4 ~1 K: t! P如果用遗传学研究生物现象，特别是用前馈遗传学（forward genetics）——随机筛选影响特定生物现象的突变——无需假设机理；这有别于通常采用的转特定基因、敲除特定基因的反向遗传学（reverse genetics）。这是遗传筛选的优点，但当时和现在都有人认为遗传筛选有很大的缺点：很多行为恐怕不是单个或几个基因所决定的，复杂的行为需要有很多基因参与，用遗传筛选对单个和少数基因有效，对更多基因参与的行为可能效果很差。1 |$ ?1 ]. F. V- |# h
* o; S8 S- q# O, e- ~对于果蝇的行为，Jerry Hirsch就认为不能用单基因解释、也就不能通过遗传筛选的方法研究行为，只能同时改变很多基因进行代间选择来推断。而本哲（Seymour Benzer，1921-2007）认为果蝇的行为可以用突变单个基因的前馈遗传学来进行研究。1970年代，他们曾发生激烈争论，Hirsch甚至给本哲所在加州理工学院的每一个教授写信称本哲的研究是伪科学。' X3 ^, i3 x. o3 G1 x4 w
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本哲3 U7 N: g( c! h8 Y& K5 d# i ^
 : n! ~+ }2 `: x; z: } e: h纽约出生的波兰犹太裔美国科学家本哲的大学是物理专业，1945年至1953年任教于普渡大学物理系，先研究过当时的热门：锗（Benzer, 1946）。1948年他开始通过参加暑期课程、访问实验室来学生物。1953年转到生物系任教，研究分子生物学，有两个很重要的工作：遗传突变就是DNA碱基序列的变化（Benzer, 1955）；基因的顺反子定义（Benzer, 1959）。& D6 o* j% l" ]5 N) i9 a- z
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►本哲与果蝇模型。图片来源：wikipedia" |0 H' \+ I; _: V* D8 `- @+ Y
& W% y6 }8 G+ ]1 \4 ^" q0 I9 d在分子生物学做出诺贝尔程度的工作后，本哲与英国科学家、DNA双螺旋共同发现者Francis Crick（1916-2004），南非犹太科学家、mRNA发现者Sydney Brenner（1927-）等认为，分子生物学的重要问题已解决、框架已建立，以后只有细节给后辈填空，而他们应该找下一个重要的领域。他们都选了神经生物学：Crick决定研究意识；Brenner决定需要新的模式生物研究神经生物学，他挑选了秀丽线虫，开发了线虫的遗传学，带出一批学生用线虫研究了发育生物学和神经生物学，虽然失去了mRNA应该获得的诺奖，但于2002年因为研究线虫获奖；本哲学习神经生物学后，决定用果蝇研究神经生物学。1967年，本哲转到加州理工学院，并开始发表果蝇行为的遗传学研究论文（Benzer，1967）。% S- C0 g: `. y; c, n
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本哲自1967年至2007年一直研究果蝇的行为。他转而研究神经生物学的初期，不仅同事笑他（研究脑袋愚蠢的果蝇，是不是研究者脑袋有毛病），而且“聪明”的学生一般不乐意跟他（你已经功成名就，不怕掉进陷阱，我们可年轻赔不起，不能舍命陪君子）。这一幕在他和Brenner身上都发生过。早期他们的学生要么不求功利、要么不懂生物、要么……总之大多都不是想安安稳稳的人。6 f' Z, L3 R7 N/ M- g
( M t2 r2 i r# G1 k* q/ ?6 z1 G本哲于1940年代末期学生物的老师、1969年诺奖得主、德国物理学家转为美国生物学家的Max Delbrück（1906-1981），这时也在加州理工学院，他听本哲说结果后，并不信找到了生物钟的基因：7 M! L3 E0 c; Z2 F% O' X8 g3 ]
& m; g3 B: j% p AMax Delbrück: “I don’t believe it.”5 [3 X0 v" u8 J- U& \
Benzer: “But Max, we found the gene! ” # d" B5 Z) l4 p- j
Delbrück: “I don’t believe a word of it.”8 V$ q0 {" U0 r7 C
" C. T) S2 w( f克隆per基因：竞争的好处 8 F, {- G+ _! x3 t; p6 q) T+ p$ F& R
1971年，因为技术缺乏，不可能得到per基因的DNA（“克隆基因”）。重组DNA技术于1973年才发明，而克隆果蝇DNA的技术还要等到1978年在斯坦福大学的David Hogness和加州理工学院的Tom Maniatis等人的工作推动下才能进行。待所有技术都成熟以后才开始研究较容易，也容易成为跟风；不待技术成熟就开始研究是开拓，但有很大的危险，如果领先几十年，可能开拓者一生也用不上。& f$ L. M; B1 A5 y w
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1980年代是基因克隆的烽火连天时代。两个团队竞争克隆果蝇的per基因：洛克菲勒大学的Michael Young（迈克·杨）；Brandeis大学的Jeffrey Hall（霍尔）与Michael Rosbash（罗斯巴希）。迈克·杨是研究果蝇出身，博士后的老师为克隆果蝇DNA的先驱David Hogness。霍尔是本哲的博士后，懂果蝇，到Brandeis后与分子生物学专长的同事罗斯巴希合作。这些科学家都还有其它研究课题，迈克·杨同时在与耶鲁大学的希腊裔生物学家Spiros Artavanis-Tsakonas竞争克隆Notch基因，霍尔还在研究果蝇性行为的fruitless基因，罗斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接机理。6 C1 h u1 g1 @( X
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►左起依次为：迈克尔·杨（Michael W Young）、杰弗理·霍尔（Jeffrey C Hall）、迈克尔·罗斯巴希（Michael Rosbash），三人曾获得2013年第十届邵逸夫奖生命科学与医学奖。 : v; B7 ]$ t6 D6 Z # k; S2 ?: c7 d% N' s( w1984年，杨迈克和霍尔—罗斯巴希两个团队都拿到Per基因附近的基因组DNA（Bargiello and Young,1984；Reddy et al.,1984; Zehring et al., 1984）。这段DNA可以产生4.5kb和0.9kb两种mRNA，所以可能对应两个基因。霍尔—罗斯巴希组观察到0.9kb之mRNA的含量有昼夜变化（Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984），认为相应的DNA为per基因。迈克·杨认为4.5kb对应的基因是Per基因。后来两个团队都确认4.5kb对应的是per基因（Bargiello et al., 1984； Hamblen et al., 1986; Lorenz et al., 1989）。将编码4.5kb mRNA的基因组DNA转入果蝇，可以使per突变种果蝇的昼夜节律恢复正常，进一步发现：改变导入的per基因表达的相位，可改变果蝇昼夜节律的相位（Edery et al., 1994）。# t j( F( D* o9 h+ }; K: V) R1 _
. G2 d0 F6 D6 U( ?' P1 {, Q3 [7 d在两个团队的竞争过程中，一个组出现错误（霍尔—罗斯巴希组最初错认了per基因），被另外一个组纠正，这是竞争对科学界的好处。& l4 t, L: E; n4 F6 S% Y
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两组科学家都确定了per基因在最初三种突变株的DNA变化：per0、pers、perl分别是提前终止、和两个不同部位的碱基变化（Baylies et al., 1987; Yu et al., 1987a）。 " D8 V( K& @8 L/ M5 ?8 Z( k + K+ L, M) @3 t0 f! t" |6 c霍尔—罗斯巴希组的中国留学生俞强还发现，缺失per蛋白质特定一段区域，昼夜活动节律不受影响，只影响求偶时果蝇翅膀有节律的歌唱（Yu et al., 1987b）。霍尔实验室在1980年发现果蝇求偶时的翅膀振荡有节律（Kyriacou and Hall，1980），其后有争议，近年有人正式提出商榷（Stern, 2014; Kyriacou et al., 2017; Stern et al., 2017）。 4 }5 P$ r# ?. `/ c, o" Q ! i+ C6 E8 S: V1 G1 K3 A霍尔—罗斯巴希组早期参与生物钟研究的中国留学生有：复旦大学本科毕业的俞强，北京医学院的刘欣（Liu et al., 1988, 1992），复旦的黄佐石 （Huang et al., 1993），武汉大学的曾红葵（Zeng et al., 1996）。 1 c" N3 n* E' j# c* I+ C2 O . d. D i4 N/ T! _: Vper的功能：竞争的坏处 1 _. o2 N; J, t' {( U / X+ K# d4 D; `( i; h# G0 V拿到基因，令人鼓舞。 & t2 y3 b' p; u- e 2 O, m) i$ m6 ]# y0 G9 W但是，拿到基因不一定就能够立即知道机理。正如测序人类基因组只是工具，而不是美国总统等政治人物在一些羞耻感比较弱的科技工作者诱导下称“测序人类基因组就是揭示人类奥秘”。今天对人类的奥秘还远远不清楚，单纯测序本身也没有自动解开人类奥秘。 * C: r: [& D' e5 A6 k+ z l( w' L5 y5 B3 x# j9 X( Z
同理，拿到了per基因的DNA，并不知道它所编码产生的蛋白质的功能，也不能推导出生物钟的机理。有时，拿到基因后很长时间都不能理解其功能，也就不能理解生物学过程或者人类疾病的机理。比如，莱—尼（Lesch-Nyhan）综合征，病人自残，是很特殊的疾病，其基因已经知道多年，编码HGPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），是核酸代谢的一个酶，但知道基因、知道蛋白质都不能告诉我们为什么病人会自残，也不能告诉我们有残害他人能力的人们绝大多数都不会自残的生理学原因。 $ G0 Z0 R2 e! y% p, ^& n0 U' s( l1 O+ i
要推出基因编码蛋白质的功能，如果其预计的氨基酸序列与其他某种蛋白质有相似性，那么功能就可能相似，从而可以提供研究的着手点。两个组都看到per蛋白质有部分序列是重复的，迈克·杨实验室还以为它相似于小鼠的序列（Shin et al., 1985），后来发现并非如此。8 h0 R5 q$ ~/ N/ f9 S
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1986年，两个课题组都发表文章称per蛋白质是蛋白多糖（Jackson et al., 1986; Reddy et al., 1986）。这次两个课题组都错了，竞争的课题组错成一样是咄咄怪事。1 s$ F. b0 E- w$ Q f" ~: J
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1987年，迈克·杨课题组与爱因斯坦医学院的David Spray实验室合作，进一步发表文章（Bargiello et al., 1987），称Per影响了细胞间交流（提示per可能起缝隙连接相关的功能，比如缝隙蛋白），这一结果很可能是从猜测per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——所以可能是缝隙蛋白的潜意识造成。但这一结果不能重复，1992年迈克·杨和Spray合作团队不得不道歉并收回1987年令人瞩目的《自然》文章（Saez et al., 1992）。霍尔—罗斯巴希组于1993年也发表文章说明Per不参与细胞间连接（Flint et al., 1993）。 1 D/ y7 ?9 l" o! K$ f 8 a1 P1 @3 z9 [# ^4 ?7 w2 F从1984至1987，在激烈竞争的过程中，两个课题组都错了两次：各自分别错了一次，同时错了一次。同一项研究错过两次的比较少，出一样的错不免尴尬。0 w/ @6 O$ ~, U$ O
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per mRNA的研究：仔细不是坏事 3 V% [; J" h. x+ L7 i4 f
 - B7 F/ ]! x; d- S. i' @) {克隆获得了基因，再看基因的表达是自然的延伸。& j: }6 g! g( j' S( m$ M% s% A( S
$ y9 J& u- \1 g0 f分子生物学的“中心法则”：DNA—RNA—蛋白质。DNA承载遗传信息，可以复制和遗传；在DNA指导下，遗传信息转录为信使核糖核酸（mRNA）；在mRNA指导下合成蛋白质，蛋白质再起各种功能。不同基因转录产生不同mRNA、得到不同蛋白质，产生不同功能。6 g: `6 y4 P/ X, r' p. U0 z
# f2 ^0 @! W( u( y7 I8 u' N检测基因表达可以检测mRNA的表达，也可以检测蛋白质的表达。一般来说，一个动物的大部分细胞含有同样的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白质。霍尔—罗斯巴希组、杨迈克组都检测per的mRNA和蛋白质表达在什么时间和空间（James et al., 1986；Saez and Young, 1988；Liu et al., 1988；Siwicki et al., 1988；Zerr et al., 1990；Liu et al., 1992），其中费了很大的劲制造per蛋白质的抗体，因为mRNA只能抗基因表达的区域和细胞，帮助理解哪些区域和细胞可能是果蝇的生物钟。但mRNA不能看到其产物蛋白质所在的亚细胞定位，而抗体可以识别蛋白质而确定per蛋白质在细胞内的位置。per蛋白质好像既可以存在于细胞核、也可以存在于细胞质（Saez and Young，1988；Siwicki et al., 1988）。到1992年，刘欣的文章才确认per蛋白质存在于细胞核（Liu et al., 1992）。 , V T, K' R# d5 ?0 P* R- i 8 I4 M% D$ E9 A) e既然per基因参与昼夜节律，那么per的基因表达（mRNA或者蛋白质）是否也有时间调控，例如昼夜差别？ 1988年，霍尔—罗斯巴希组提出per的蛋白质有昼夜变化（Siwicki et al., 1988）。per的mRNA是否有昼夜变化？理论上，研究RNA变化比研究蛋白质容易，因为不依赖于获得好的抗体，而只要得到基因的DNA就很快可以通过普通的分子生物学方法研究mRNA的表达。但最初未见per的mRNA昼夜变化。一个可能是做实验的人技术不好、或不仔细，一个可能是偶然的：传说最初检测per mRNA的人，是从果蝇全身获得RNA，只分昼夜时间、不分身体部位。而出现突破的1990年，是从果蝇头部提取RNA，避免其他部分（如腹部）所含RNA掩盖了头部mRNA。0 a5 x3 ~% E, [) F* C
! _$ N5 W& ~5 |3 w5 I: E0 n为什么需要专门研究头里的per基因？这与昼夜节律的关键部分存在于身体什么部位有关。在得到per基因突变后，Handler和Konopka专门在不同突变型的果蝇之间进行局部细胞的移植，以便确定哪个部位起决定性作用。从pers果蝇取得脑组织，移植到per0果蝇腹腔中，发现per0变成了pers，显示脑确定节律（Handler and Konopka，1979）。1983年，离开加州理工学院在Clarkson大学的Konopka等再用遗传嵌合体做实验，让果蝇部分区域的细胞含突变的per（如pers），而其余部分仍然正常，结果发现：如果脑含pers，果蝇的生物钟就变短（Konopka et al., 1980）。所以，移植实验和嵌合体实验皆支持per基因在脑中控制全身的昼夜节律。 9 q% N* n& T$ O- @+ u2 a" S& I4 O 6 A5 }3 g2 D+ f5 n. h1990年，霍尔—罗斯巴希组的博士后Paul Hardin终于每个小时取果蝇的头得到mRNA，再检测per的mRNA，发现它呈昼夜变化（Hardin，Hall，Rosbash，1990）。在pers中，per的mRNA昼夜周期也缩短。他们提出简单的模型：per的基因转录per的mRNA、翻译产生per蛋白质的过程存在负反馈，per的mRNA或蛋白质产生后，可以影响per基因自身的转录。他们当时不能排除per调节昼夜节律这一行为之后，行为再通过更复杂的反馈作用于per基因转录。这里需要用Occam剃刀原则（奥卡姆剃刀），即首先检测最简单的可能性。这一简单解释提供了生物钟机制的理论突破，是迄今为止仍被公认的“转录—翻译负反馈环路（transcription-translation feedback loop, TTFL）”的基础，罗斯巴希称赞提出这一模型的博士后Hardin。9 o' N8 b6 F% y) ^ m: s$ v/ _* a
1 a. u& u* [1 q* N: N2 x如果这一假设正确，那么per蛋白质就是基因的转录调节因子。而对于转录因子，1980年代有很多进展，从而可以为研究per和生物钟的机理提供很好的借鉴。8 S0 H" p5 T* ^- J+ Q# H4 @7 z
" S/ Y) X. }* l6 d2 W# d不久，霍尔—罗斯巴希组的Zerr又用抗体检测提出per蛋白质的表达，在部分脑区也有昼夜节律，这种节律的长短也被per本身所调节，因为在生物钟缩短的果蝇突变种pers中，per的蛋白质昼夜周期也缩短（Zerr et al., 1990）。mRNA的昼夜节律与蛋白质昼夜节律之间有一定的间隔，也就是相位不同。几年之后知道不仅per蛋白质含量变化，而且其亚细胞定位变化：昼夜周期中，per蛋白质进入细胞核的时间有昼夜周期变化（Curtin et al., 1995）。 m9 N! s' C' L" a7 r/ R
3 u: p! K& T/ d) \# {& ` _基因转录调控$ Y5 a3 H) `5 s0 |* } _
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1990年，研究果蝇生物钟的Hardin等提出per蛋白质可能调节基因转录，依据的是间接证据。& f0 I- h! L, k+ X& }$ z `2 O' H
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1991年和1992年，其他途径的研究发现了几个与per有相似性区域的蛋白质。研究果蝇胚胎发育的Crews实验室发现一个基因single minded（sim），其缺失导致果蝇胚胎腹侧中线的神经细胞缺乏（Nambu et al., 1990）。研究环境致癌物的Hoffman等和Burbach等，发现一个被致癌物二恶英(dioxin)作用的受体Ah R（Hoffman et al., 1991；Burbach, Poland, Bradfield, 1992）。per、Ah R和sim三个蛋白质都相似的区域称为PAS区域。: O0 o0 M( T% ^0 A9 t! L: m
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因为AhR确定是转录因子，而且有专门调节转录的区域bHLH，所以提示per和SIM也是转录调节因子，但per缺AhR具有的转录调节区域，只有PAS区域。1993年，罗斯巴希实验室的黄佐石证明，PAS区域是蛋白质—蛋白质相互作用区域，PAS和PAS可以偶聚化（Huang, Edery and Rosbash，1993）。进一步研究提出，具有bHLH和PAS区域的蛋白质可能是转录激活因子，而只有PAS但缺乏bHLH的per蛋白质不能激活转录但可以抑制能够激活转录而同时有bHLH和PAS区域的蛋白质（Lindebro, Poellinger and Whitelaw，1995）。( X2 ~" Z7 O0 g5 f, P, f# _" C
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Hardin自己独立实验室后，证明per蛋白质调控per基因转录，依赖于per基因在蛋白质编码区域之上游（分子生物学称为5’端）的DNA序列（Hao, Allen and Hardin, 1997）。以后有更多证据表明，per参与转录调节，而且与多个基因有关。* }9 P" I+ B8 T) _. G
6 C$ j/ H1 l* a2 U6 [. e* M更多参与果蝇生物钟的基因 " s# b- ~% r. }& t! z3 L! ?4 ~4 h1 [- a: u/ V
影响生物钟不可能只有一个基因。 7 l) h0 f7 P l8 H" O% `2 f$ o D% q2 f" b# A
1971年发现第一个影响果蝇生物钟的基因per。7 o: [% e1 C. y& Z- k
( q8 e$ D) o/ p, u4 f7 f当然，在从各种生物得到答案之前，人们无法预料生物钟的机理保守的范围。但事后可以总结果蝇对于生物钟研究的重要性。& w1 @1 G/ D' T% b _' z5 E# j
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并非所有低等生物的研究都适用于高等生物，有些相通、有些不同。例如：细胞周期的原理从酵母到人都保守，而性别确定的机理从果蝇到人类并不保守。虽然研究低等生物特有的生物学原理也有科学意义，但人偏于关注对高等生物适用的分子和规律。 ) K( i7 c9 ?, d( I0 p' y $ U1 t8 G/ o9 M+ E/ I在发现per、andante、tim等基因之后，科学家们还多次用果蝇继续筛选影响生物钟的基因。8 R: w- U9 I! q5 ]; U2 c% d J
" s0 P0 w/ }9 C {' B& k霍尔实验室建立用荧光素接在per基因位点，用酶活性间接报告per的转录情况（Brandes et al., 1996；Stanewsky et al., 1997； Plautz et al., 1997），筛选了5137株影响荧光素表达的果蝇突变种，发现chryptochrome （cry）基因参与果蝇生物钟（Stanewsky et al., 1998）。用果蝇的遗传研究发现cry的作用在于介导外界的光调节身体内在的生物钟（Stanewsky et al., 1998）。生物钟在没有外界环境影响的情况下，可以自行运转。在外界环境作用下，生物钟与外界相配合。虽然其他如声音、温度、进食也可影响生物钟，外界的光当然是调节生物钟的关键因素之一。cry功能的发现解决了一个重要的问题。这里也可以看到，遗传筛选不仅为了找到基因，而且有时可能从基因编码的蛋白质推测出分子机理，而了解机理是生物学基础研究的核心。cry本身的mRNA表达也有昼夜节律，它也调节per和tim表达与光的关系（Emery et al., 1998；Stanewsky et al., 1998）。 * B b1 y, M0 m- r- _; |
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果蝇有4套染色体。罗斯巴希—霍尔合作筛选第三号染色体，用化学诱变得到遗传突变种，筛选了6千多种以后，发现jrk基因（Allada et al., 1998）。令人欣慰的是，果蝇的jrk原来就是小鼠Clock基因的同源基因。再找到的cycle基因，也有小鼠的类似基因Bmal（Rutila et al., 1998）。再度证实从昆虫到哺乳类用同样的基因调节生物钟。 , |! v" K* C- c8 @+ \9 z( Q) O& ~ ]! o# j7 ]2 d n
杨迈克实验室在果蝇的第2和第3号染色体筛选了多于1万5千种突变，发现了他们命名为doubletime的（“加时”）基因，而它编码了酪蛋白激酶ε（CKIε）（Price et al., 1998）。它可以调节per蛋白质的稳定性。高桥实验室于2000年克隆了金仓鼠的tau基因，发现原来也是CKIε（Lowrey et al., 2000）。开始研究蛋白激酶导致磷酸化、磷酸化调节蛋白质稳定性。 ! d; i- V2 b4 V8 l" P" {1 q. q/ w6 k6 m5 g3 `5 B: L* x8 u; A
到2001年，已知多个基因在果蝇和小鼠都调节生物钟：包括果蝇的一个per和小鼠的三个Per基因、果蝇的一个cry和小鼠的两个Cry基因、果蝇的一个jrk/clock和小鼠的两个Clock基因（Clock和Npas2）、果蝇的cycle和小鼠的Bmal1基因、果蝇的doubletime和小鼠的CKIδ和CKIε基因（Reppert and Weaver, 2001）。! W; M3 u$ t5 {9 y
* k$ R* Z- Y: s; ?/ r0 h0 ]筛选生物钟相关基因的其他途径 / i0 i1 o- U' ?6 S0 T0 U8 p) y 9 C) t% N0 n4 P' v9 ^在完全不理解分子机理的情况下，用遗传筛选生物钟，是很强的方法。从分子上，称之为“盲筛”，未尝不可。盲筛的优点在于无需事先知道机理，而通过遗传得到突变、DNA克隆得到分子、分子的序列特征或更多研究，再揭示机理，或提供揭示机理的可能性。这是一些人所谓的“遗传学的令人敬畏的力量”（the awesome power of genetics）。这一途径被用于多个重要问题的研究，生物钟是早期的研究对象之一，但非唯一。 ; b! `; ?7 T' Y0 S' a! \# {4 S! P/ f0 ~& J. g8 l
在有其它线索时，在有其他突破点时，自然也无需假定遗传学是唯一途径。9 `; I; N* k/ \+ a0 S- q7 Y: ~
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在生物钟研究中，当人们知道Per的mRNA表达有昼夜节律， Per蛋白质与Tim蛋白质有相互作用，蛋白激酶参与生物钟，那么可以通过这些特征找其他基因（Abruzzi et al., 2017）。当技术发展，如分子生物学的RNAi（RNA干扰）技术等之后，也自然可以用新技术研究老问题。 ' n( L; V8 y; \7 C# E, V! F y * s. c1 T9 K* M2 a% P e: {事实上，早在1995年，哈佛医学院Weitz实验室的Gekakis等通过Per蛋白质寻找与Per直接相互作用的蛋白质，找到Tim蛋白质，发现Tim与Per两个蛋白质直接结合（Gekakis et al., 1995）。他们用酵母双杂交得到的这一发现与同期迈克·杨实验室用果蝇遗传筛选的途径异曲同工。而当时在美国圣地亚哥加州大学（UCSD）Steve Kay实验室做博士后的张二荃首次用RNAi筛选生物钟的基因，他利用当时已知多种细胞有生物钟，而在体外培养的人类细胞用Per基因插入荧光素基因，通过荧光素基因的表达周期显示生物钟，张二荃因此找到影响人类生物钟的基因（Zhang et al., 2009）。当然用活人是很难筛选基因的，但用体外培养的细胞就容易多了。 1 ?' Q) |, D; V1 Y, J* I" ~/ Y6 m! j1 \0 e
从1971年的果蝇筛选到2009年人的筛选，研究的时间跨度很大，但基因并没有找全。果蝇的筛选就没有筛完，而是每次都有局限，哺乳动物的筛选更没有完。如果以后有更多、更好的途径和方法，包括现有和已经用过但并未充分使用的方法，再发现影响生物钟的基因，不会令人惊讶。9 I } d/ ~2 J& R0 o. e
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分子机理和细胞机理7 f L7 u- L- R
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发现基因固然重要。 + n3 O: c( v, l0 p) |, [; r- N S1 d m& V2 J& k7 Y* j
但生物学基础研究的目的是阐明机理。0 ~; G; a7 l4 Y: g" z" W( \
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综合多年的研究结果，可以看到，Per调节基因转录，是分子机理的突破。简而言之，Clock和Cycle蛋白质组成复合体，直接刺激一些下游靶基因的转录，这些靶基因进一步控制生物钟。而Per和Tim蛋白复合体抑制Clock和Cycle的作用。Per基因和Tim基因本身还是Clock和Cycle的靶基因，从而组成转录反馈环。Per蛋白质的稳定性被磷酸化所调节，也就被doubletime或CK1δ和ε等蛋白激酶和去除磷酸化的蛋白磷酸酶所调节（Wijnen and Young,2006；Benito et al., 2007）。还有糖化修饰调节Per和Clock蛋白质。Cry介导光调节Tim/Per的稳定性。在Clock/Cycle和Per/Tim参与的主要转录环之外，还有其他转录环。还有其他基因如pdp1、vri、RORa和REV-ERBα参与转录调控。 0 J& ^6 e6 \9 v+ @5 p8 R( M& r / q9 s) h/ q# _& z* J6 }Per和Tim蛋白质不仅有稳定性的问题，而且还有亚细胞定位问题：在细胞浆？还是细胞核？作为转录调节因子，它们只有在进入细胞核才能见到基因调节的机器，才能调节基因转录（Siepka et al., 2007; Dubowy and Sehgal,2017）。Per和Tim的mRNA在白天逐渐升高，到傍晚大大最高峰。两个蛋白质的合成晚于其mRNA几小时后逐渐积累，先在细胞浆，午夜进入细胞核。Tim蛋白质既在细胞浆内稳定Per蛋白质，也促进Per进入细胞核（Meyer, Saez and Young, 2006）。6 {' v) e" i. l' U3 y3 n7 S, Q" j, G
, o6 G4 i+ h5 `6 y" I有趣的是，虽然细菌、真菌、和植物分别由其他分子组成生物钟，核心都是振荡器。这些生物的振荡器由不同的分子组分，也是通过正反馈和负反馈来实现。外界的光或其它因素通过一定方式影响生物钟的它们也用了转录调控、和磷酸化调节等（综述见Wijnen and Young，2006）。而植物的生物钟还用了细胞浆和细胞质定位的调节（Wang and Tobin，1998；Mas，2008）。因此，从细菌到人不同生物的生物钟存在原理的共同性。& |7 ~ c& z# P# V' R' ]
. l, \! e+ I) r- f, G) k- R; Y$ P在细胞层面，目前认为，动物体内绝大多数细胞（甚至所有细胞）都有生物钟（Emery et al., 1997；Giebultowicz and Hege, 1997；Plautz et al., 1997）。果蝇的翅膀切下后依然可以观察到其中的生物钟影响，人的肝脏细胞体外培养也表现出代谢上的节律。现在认为生物钟分为中枢的主钟和外周的钟。 ) T7 v: ?' L% L: a- @& E, R2 P4 \; H# S- w9 ~
在果蝇体内，推测大约150个表达Per和Tim基因的神经细胞组成主钟（master clock），在哺乳类由SCN组成主钟。小鼠的SCN含约两万个细胞，人的SCN约五万细胞。外周钟可以自行运转，但主钟控制全身的外周钟，特别是同步化外周钟。 & o( p. r" K' `2 ~' m( y G1 O: b/ D, \Konopka和Benzer在1971年的文章就指出，突变基因起作用的解剖部位很重要。也就是说如果能够找到这些细胞，就可能找到主生物钟。一般推测果蝇脑含约25万个神经细胞，而其中150个细胞是主生物钟的推测是依据Per和Tim的功能和基因表达部位（Konopka and Benzer,1971; Vosshall and Young, 1995; Kaneko, Helfrich-Forster, Hall, 1997; Panda，Hogenesch and Kay, 2002; Helfrich-Forster, 2005）。它们包括：背侧的神经元DN1、DN2、DN3，侧后神经元LPNs，侧面偏背神经元LNd、侧面偏腹小神经元sLNvs、侧面偏腹大神经元lLNvs。其中lLNvs神经元全部含PDF神经肽，而5个sLNvs中4个含PDF（Nitabach and Taghert, 2008）。PDF在生物钟也起重要作用（Renn et al., 1999）。这些细胞的功能也不一样，含PDF的sLNvs细胞为控制果蝇早上活动的早晨细胞，而LNd和不含PDF的sLNvs细胞为控制果蝇傍晚活动的傍晚细胞。 p# ^, k) J& r+ w8 L+ u# q; v# Z7 m0 ?& \/ d( d# O, Q: Z+ M5 u
哺乳动物的主钟内部也有分工和协调。SCN的神经细胞分离的状态下，分别有节律但不同步，而它们在一起时节律同步，有神经肽等分子参与，有神经网络。9 W: n" W; T8 M" Y# t
; ~6 Q7 h s" I2 |/ [人的生物钟相关基因/ Y! D1 X" Q' W
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虽然生物钟对人很重要，而我们较晚理解人的生物钟理解。遗传和基因分析起了突破性的作用，并且与果蝇相似。 " `, i0 ]% v I: l. C/ i" o m3 a9 t. `0 c: x用8753对成年双胞胎的研究表面，人的昼夜节律与很强的遗传性（Koskenvuo et al., 2007）。; o4 q$ f$ }8 ~" G8 v7 j( Y
3 i1 d8 G( |7 L2001年，旧金山加州大学（UCSF）的Ptácek和Fu两个合作实验室发现，人的Per2基因（hPer2）与人的生物钟相关。他们研究了一家遗传性的相位变化。这家人的相位变快（家族性睡眠相位提前综合征，FASPS），每天早上4点半醒，晚上7点半要睡，相位比一般人提前4小时。Ptácek和Fu对此家系的遗传分析发现，他们中凡有hPer2编码的特定位点（对应于其蛋白质序列的662位氨基酸）变化后，就患相位提前的病，凡是这个位点正常的人，就没有相位提前病（Toh et al., 2001）。662位点相应的氨基酸是丝氨酸（简称S），他们当时以为S662是由CKIδ所磷酸化。2005年在Ptácek和Fu实验室工作、现任教于苏州大学的徐璎发现CKIδ基因突变也能在人和小鼠导致相位提前（Xu et al., 2005）。* G( K. F% t: _
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其后有更多基因被发现参与人的生物钟（He et al., 2009）。迈克·杨实验室于2017年发现人的Cry1基因突变可以导致生物钟相位推迟（晚睡晚起）（Patke et al., 2017）。 ( B" I# |" K' a+ n, L+ K, W, W4 L7 O# L6 @
运气和勇气：孰轻孰重! W- y9 Z4 F: j7 n# }) O
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生物钟遗传研究确实有运气，但也有勇气。 0 |5 Q3 n9 s3 \ i5 F$ C+ w* A, k6 t* ^) T
在看不清前途时默默探索，在一个小领域内长期耕耘；遇困难出差错恐在所难免，碰运气获机遇也时有所得。4 `3 c; r0 _- X0 u9 V) D
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粗看似乎运气重要，细看可见勇气重要：勇于做前人没做过、旁人没想过、伟人不相信的工作。 % Z% W7 y0 ~. y8 n2 q+ x; Z9 I% ]: i3 a/ Q. w7 x C
Konopka和Benzer从两千只果蝇中筛到三只突变果蝇，竟然是同一个基因的三个影响完全不一样的突变。遗传学研究的历史上可能只有这一次小规模筛选中出现一个基因的三个功能改变的情况；生物学历史上，这可能也是绝无仅有；说不定科学史上也是凤毛麟角。如果没有这样的突变，可能还有些人会比较犹豫生物钟能否用遗传进行研究，因为可以设想一些在果蝇生物钟筛选方法中有表型，但不一定反映生物钟核心机构的基因。表型能否可靠并直接地帮助遗传学家研究核心问题，是一个非常重要的问题。果蝇生物钟的表型，几十年后的今天看来非常可靠，但当初并不清楚。正如今天问：从果蝇检测的睡眠，是否真是睡眠？很多人，包括研究果蝇的科学家，都不敢清晰地回答这一问题。 1 [' A# b& M3 q% A; y+ i' P3 f % L2 K2 q$ u( N0 R1 A& R' G高桥实验室在老鼠的筛选过程中，第25只老鼠就是影响生物钟的突变，也有很大的运气。如果没有这样的运气，就要花很多的时间，而且老鼠的研究很费钱，没有足够的人力物力就做不成。一般人预计到成本，就不能做这样的研究。) l% ?6 o" g) n% n$ m1 f/ b
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现在我们可以事后诸葛亮，总结以后多个实验而意识到：实际上只要做足够的筛选，不是筛两千只果蝇，而是筛两万只果蝇，基本一定能找到生物钟的突变。虽然不会得到一个基因的三种不同方向的突变，但同样会带来突破的可能性。多次筛选果蝇生物钟突变种的多次筛选，只有两次比较倒霉，一次是重复发现以前的基因、一次搞错了，其他都找到基因，而且是新的基因。+ U5 d4 F& `; ~) U! m% i
) h1 N& I3 Z: {4 V高桥实验室用老鼠筛选生物钟突变基因，也有运气。但事后看来，如果有决心、经费够，筛选超过几千只就应该能得到影响生物钟的基因。而几千只老鼠的经费，并非只有高桥实验室才有。对这一经验的总结并非徒劳，原在美国西南医学中心、现在日本筑波国际睡眠医学研究所的Masashi Yanagisawa及其团队，就用较大经费专门筛选小鼠睡眠的突变种，找到影响小鼠睡眠的基因（Funato et al., 2016）。 X- ~8 [$ k2 Z5 h2 A
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Konopka在研究过程中遇到了生物学空前绝后的运气，但个人机遇却相当不好。他毕业后到斯坦福大学做过短暂博士后，1974年回加州理工任助理教授，但评终身教授时未通过，主要原因是文章太少。他到Clarkson大学任教，因人事变动，再次未获终身教授，1990年回到加州辅导高中生，2015年心脏病去世（Rosbash，2015）。& M. K! n( V: z, S8 p0 n: r0 r
( T- K# e8 B& s. @悬而未决的问题6 J: [& \- r) T6 o
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今天，生物钟的重要问题并未全部解决。$ t. I+ k+ Z% _
: M1 R# c$ j+ z" N% N" M) f. A+ @1 f; p: {已经发现的参与生物钟的基因，其机理并非完全清晰。例如，研究的最多、时间最长的是Per，但迄今并不十分清楚Per蛋白质如何调节基因转录。再如，Ptácek和Fu实验室从2001到2005的研究表明hPer2在S662位点磷酸化很重要，并提出CKIδ是磷酸这一位点的蛋白激酶。但令人惊讶的是，徐璎在他们实验室于2007年发表进一步工作表明CKIδ蛋白激酶并不能磷酸化hPer2蛋白质的S662（Xu et al., 2007）。因此，自从2001年发现的对人的生物钟至关重要的S662位点，居然迄今不知道其蛋白激酶。17年来，不同实验室努力试过找识别磷酸化S662位点的抗体，以便简单、快速检测S662是否磷酸化，迄今无成功的报道。Per蛋白质有多个可以被磷酸化位点，它们确实在体内被磷酸化吗？它们各有什么功能意义？ P) J% x' l+ R# Y, O/ A* Y L0 g6 s; w4 \' e/ V# D
了解参与生物钟蛋白质，能否构建很好的数学模型，在定性的基础上迈进定量的时代？; q$ A; ?6 k9 Z' Z2 u$ C* j
8 J, l7 s6 t0 F3 v! q5 i主钟细胞内的基因恐怕没有穷尽，而是还有。 b2 r, |9 ~0 |) Z# D! X7 y" S( m
主钟的细胞间如何相互作用？只是神经细胞参与生物钟，还是有神经胶质细胞参与（Tso et al., 2017）？环路如何构建？# w$ ^' _6 j$ Y
6 l7 n9 t0 [0 ~7 b. \% c }中枢主钟如何调节外周钟？无论在果蝇还是哺乳类，都不能说十分清楚。果蝇这方面的一个研究论文被撤稿。而高桥实验室提出小鼠的主钟通过调节体温而协调外周钟，也不一定是普遍为人们所接受。 + Q0 C: I* S% v; R. L7 \1 f, c3 s2 X9 P* ?
生物钟与代谢、代谢疾病的关系及其机理（Turek et al., 2005; Lamia et al., 2008; Marcheva et al., 2010; Robles, Humphrey and Mann，2017）4 [5 z# X# c7 r; n6 ~' v
@3 }: K) |1 _+ C本文讨论的生物钟，主要是近24小时的昼夜节律。还有非24小时的其他节律，它们的机理是什么？ 9 m% l& r- z* `* R# Q, W8 ]" ], e2 f3 F7 C* g
基础研究之外，生物钟的研究应该可以产出人类应用的成果，但生物钟研究迄今没拿出调节时差的药物。现代社会对于调节时差有较大需求。各种值班导致英美近六分之一的上班族需要调时差，而且人类跨时区旅行量每年数以亿计，老年人睡眠问题相当部分是生物钟异常所致，所以调节时差对于工作效率和生活质量都很重要。大药厂保守僵化，拘泥于已有领域（癌症、神经精神、抗感染……），对于时差不重视可能是原因之一。6 ]! B9 Q/ q- x) H" e
1 T# U) T: y P- B [, c理论上与生物钟相关的问题中最重要的，是迄今理解不多的睡眠。理解生物钟可以解释睡眠的相位（何时睡），但不能解释睡眠本身。睡眠的机理目前理解很少。教科书中睡眠的内容相当大部分是脑电图的描绘，是现象的描述不是机理的理解。睡眠研究任重道远。Orexin及其受体的研究曾认为是突破，但带来的进展有限。而2016年柳沢正史（Masashi Yanagisawa）及其合作者发现的Sik3基因，是否是睡眠分子机理的关键突破，值得拭目以待。（完）6 |% d% g( s& G' u+ ~5 \, x/ V
! z& H+ ^, Y& R0 ~, u作者注：本文起源于授课，文字始于2014年10月6日，继续于2015和2016年10月，第一稿完成于2017年10月1日，10月2日部分修改。 + T+ i/ Q% S( E. }5 w3 c1 i0 f; o/ L6 X5 u" X: j. W; b- {& |
注1：果蝇的四次诺贝尔奖为1933年美国的摩尔根（丰富染色体遗传学说和规律），1947年摩尔根的学生穆勒（发现X线诱导基因突变），1995年美国的路易斯、德国的钮斯兰-沃哈特、美国的维西豪斯（发育的基因），2011年法国的霍夫曼（先天免疫的基因）。/ _1 @7 p& k. V: A
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